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| 如何操作Agilent 1100型高效液相色譜儀 |
| 【來源：桂西制藥】【作者：admin】【發(fā)布時間：2010-12-16】 |
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儀器各組件
泵 ：四元泵、二元泵
在線脫氣器
進樣器：自動進樣器及手動進樣器
柱溫箱
檢測器： DAD檢測器、UV檢測器
何時需要使用Agilent在線脫氣機
如果在低UV波長段，用最高靈敏度進行檢測
如果要求使用最佳進樣精度
如果要求保留時間重現(xiàn)性很高（在0.5ml/min流速以下）
如果樣品和檢測對流動相中溶解氧敏感
開機
打開計算機,進入Windows NT 或Windows 2000 畫面,并運行Bootp Server程序（點擊左下方【Bootp Server】圖標(biāo)）
打開色譜儀各組件電源，待Bootp Server里顯示已聯(lián)上各組件的信息及各模塊自檢完成后，雙擊Instrument 1 Online ，圖標(biāo)打開工作站。化學(xué)工作站自動與1100通訊。
排氣
將流動相放入溶劑瓶中，打開Purge 閥，依次單擊【Pump】→【Set up Pump】，設(shè)Flow為2ml/min，單擊OK ，再依次單擊【Pump】→【control】，選中on，單擊OK，則系統(tǒng)開始Purge至管路無氣泡為止，切換管路反復(fù)操作至所需管路均無氣泡。
在【control】選項中選off，關(guān)閉泵，關(guān)閉Purge 閥。單擊泵下面瓶圖標(biāo)，輸入溶劑的實際體積和瓶體積。
打開10％異丙醇溶液控制閥，用針筒抽吸至管路中有液體流出。調(diào)節(jié)控制閥松緊，控制流量至流出量約為每分鐘5～15滴。
編輯分析方法
新方法建立：點擊【Method】，點擊【Edit entire method】或【New method】選項，進行方法編緝。
在Method Comments 中加入方法的信息如色譜條件、方法的用途等點擊Ok進入下一畫面
泵參數(shù)設(shè)定：設(shè)定流速、比例、梯度、運行時間、平衡時間等。點擊Ok進入下一畫面
自動進樣器參數(shù)設(shè)定：設(shè)定進樣量、洗瓶位置、進樣方式等
進樣方式：“Standard Injection”只能輸入進樣體積“Injection with Needle Wash”可以輸入進樣體積和洗瓶位置此方式針從樣品瓶抽完樣品后會在洗瓶中洗針
Use injector program：可以點擊Edit 鍵進行進樣程序編輯
柱溫箱參數(shù)設(shè)定：在”Temperature”下面的方框內(nèi)輸入所需溫度,并選中它,點擊”more>>”鍵,選中“Same as left”使柱溫箱的溫度左右一致。點擊Ok進入下一畫面
檢測器參數(shù)設(shè)定－UV：在”Wavelength”下方的空白處輸入所需的檢測波長,如254nm, 在“Peakwidth (Response time)”下方點擊下拉式三角框,選擇合適的響應(yīng)時間, 如>0.1min(2s)，在Timetable 中可以Insert 一行輸入隨時間切換的波長。點擊Ok進入下一畫面
檢測器參數(shù)設(shè)定－DAD
樣品波長--一般選擇最大吸收處的波長
樣品帶寬BW—一般選擇最大吸收值一半處的整個寬度
參比波長—一般選擇在靠近樣品信號的無吸收或低吸收區(qū)域
參比帶寬BW—至少要與樣品信號的帶寬相等許多情況下用100nm作為缺省值
Peak width Response time 其值盡可能接近要測的窄峰峰寬
選中所用的燈點擊Ok進入下一畫面
方法保存
單擊Method 菜單選中Save method as 輸入一方法名，如test
單擊Ok
選擇已有方法：點擊【Method】，點擊【Load method】選項，選取已存的各種操作方法。
樣品分析與采集數(shù)據(jù)
將樣品放于樣品盤中相應(yīng)位置，所有的樣品均需澄清。
待儀器顯示Ready，基線平穩(wěn)，從【Run control】菜單中選擇【Run Method】，開始進樣分析。或點擊【Start】開始進樣分析。
數(shù)據(jù)處理：單擊【View】菜單，單擊【Data analysis】選項，進行數(shù)據(jù)分析。單擊【View】菜單，單擊【Method and Run control】選項，回到樣品分析界面。
數(shù)據(jù)分析方法編輯
從File 菜單選擇Load signal 選中您的數(shù)據(jù)文件名
單擊Ok
積分
從Integration 中選擇“Auto integrate”,如積分結(jié)果不理想,再從菜單中選擇Integration Events 選項選擇合適的Slope sensitivity 、Peak width 、Area reject、 Height reject。
從Integration 菜單中選擇Integrate 選項則數(shù)據(jù)被積分
如積分結(jié)果不理想則修改相應(yīng)的積分參數(shù)直到滿意為止
單擊左邊圖標(biāo)將積分參數(shù)存入方法
關(guān)機
沖洗系統(tǒng)：反相柱用10％的甲醇水沖洗系統(tǒng)30分鐘，再用100％甲醇沖洗系統(tǒng)20分鐘，然后關(guān)泵，正相柱先用合適溶劑沖洗，后用柱保存液沖洗。
退出工作站，關(guān)閉計算機。
關(guān)閉10％異丙醇溶液控制閥。
關(guān)閉儀器各組件
關(guān)掉Agilent 1100電源開關(guān)
注意事項
1、色譜柱使用前仔細(xì)閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，如pH值范圍、流動相類型等；必須使用保護柱；色譜柱長時間不用時，柱內(nèi)應(yīng)充滿溶劑，兩端封死保存。
2、流動相使用前必須過濾，不要使用多日存放的蒸餾水（易長菌）。
3、儀器運行時，泵頭必須用10%異丙醇水溶液虹吸沖洗，不能干涸。
4、注意各流動相所剩溶液的容積設(shè)定，若設(shè)定的容積低于最低限會自動停泵。
5、對于手動進樣器當(dāng)使用緩沖溶液時要用水沖洗進樣口同時搬動進樣閥數(shù)次每次數(shù)毫升
6、若使用含鹽流動相，開機時必須先用10%甲醇水溶液沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動相。
7、溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎，在更換流動相時注意保護，當(dāng)發(fā)現(xiàn)過濾頭變臟或長菌時，不可用超聲洗滌，可用35%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌。
8、檢測器的燈有使用壽命限制，一般在正式進樣分析前30min 左右開啟D燈或W燈，分析結(jié)束，立即關(guān)燈。
9、使用雙泵時，A、B、C、D四相中，若所用流動相中有含鹽流動相，則A、D（進液口位于混合器下方）放置含鹽流動相，B、C（進液口位于混合器上方）放置不含鹽流動相。
溶劑和樣品過濾的重要性
對色譜柱、儀器起到保護作用
由于填料顆粒很細(xì)色譜柱內(nèi)腔很小，溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會使色譜柱堵塞
儀器溶劑和樣品中的細(xì)小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損同時也會增加泵頭內(nèi)的藍寶石活塞桿和活塞的磨損
消除由于污染對分析結(jié)果的影響
樣品過濾頭的類型
30mm內(nèi)徑適用于大進樣量的過濾由0.2µm和0.45µm兩種規(guī)格,材料有纖維素,醋酸纖維,聚四氟乙烯處理樣品體積少于50µl
13mm內(nèi)徑適用于一般進樣量的過濾由0.2µm和0.45µm兩種規(guī)格,材料為纖維素
3mm內(nèi)徑適用于小進樣量的過濾由0.2µm和0.45µm兩種規(guī)格處理樣品體積為7µl
濾膜類型
聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑、酸和鹽。無任何可溶物脫落。
醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶液。可用于蛋白質(zhì)和其相關(guān)樣品
尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液可用于強酸、70%乙醇、二氯甲烷。不適用于二甲基甲酰胺。
再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低同樣適用水溶性樣品和有機溶劑
流動相脫氣的重要性
防止因產(chǎn)生氣泡增加基線的噪音，造成靈敏度下降甚至無法分析
溶解的氧氣可能會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化
柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能
若用FID 可能會造成熒光猝滅
常用的脫氣方法比較
氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低連續(xù)吹氦脫氣效果較好但成本高
加熱回流法：效果較好但操作復(fù)雜且有毒性揮發(fā)污染
抽真空脫氣法：易抽走有機相
超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中用超聲波振蕩10～15min 此法效果最差。
在線真空脫氣法：真空脫氣機利用膜滲透技術(shù)
在線脫氣智能控制無需額外操作成本低脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法并適用于多元溶劑體系
如何防止溶劑瓶內(nèi)溶劑過濾器的堵塞及其處理
請嚴(yán)格執(zhí)行溶劑過濾
請勿使用多日存放的蒸餾水及磷酸鹽緩沖液
如果應(yīng)用許可可在溶劑中加入0.0001---0.001M的疊氮化鈉.
在溶劑瓶內(nèi)溶劑的上方小流量連續(xù)吹氬氣,以隔絕空氣
避免使溶劑瓶暴露在直射陽光下盡量使用琥珀色的溶劑瓶盛放水溶液或磷酸鹽緩沖液
堵塞后的處理法方法：
將過濾頭從組件中取下在35%硝酸液中浸泡1h，然后用二次蒸餾水沖洗干凈。
思考
1.如何簡單判斷脫氣機脫氣是否正常？
2.如何簡單判斷脫氣機腔體或溶劑過濾頭是否堵塞？
泵的維護
1、流動相使用前必須脫氣過濾
2、使用緩沖鹽時要加在線Seal-wash選項
3、關(guān)機前反相色譜柱用10%的甲醇水沖洗系統(tǒng)20分鐘，然后用有機溶劑沖洗系統(tǒng)10分鐘，然后關(guān)泵。正相色譜柱用適當(dāng)?shù)娜軇_洗。
4、及時更換Purge Valve內(nèi)的過濾芯，當(dāng)打開Purge Valve時壓力高于10bar 表明過濾芯已堵
5、使用合適的密封圈：標(biāo)準(zhǔn)密封圈能適合于大多數(shù)應(yīng)用。但使用正相溶劑最好使用聚四氟乙烯密封圈，泵的壓力限制最大壓力設(shè)為200bar。
6、使用梯度比例時的注意事項：
當(dāng)鹽溶液與有機溶劑溶液混合時鹽溶液能與有機溶劑溶液完全混溶而不會出現(xiàn)沉淀。
由于在比例閥的混合點重力作用使鹽顆粒沉淀下來通常閥A接水相/鹽溶液D接有機溶劑此法連接可有效使鹽回落到鹽溶液中并被溶解若顛倒過來鹽可能落在有機溶劑中出現(xiàn)問題
當(dāng)使用緩沖鹽溶液和有機溶劑時推薦將緩沖鹽通道接在A通道上有機溶劑通道直接接在A通道的上方D通道上定期用水沖洗所有的通道以除去閥口上可能出現(xiàn)的鹽沉淀
手動進樣閥使用注意事項
進樣量的多少要根據(jù)定量管的LOOP體積決定
當(dāng)樣品量少時進樣體積由注射器的進樣體積決定但最大進樣體積要小于1/2loop體積
當(dāng)樣品量較多時進樣體積由定量管的體積決定為保證樣品完全把定量管的流動相置換干凈需注射5—6倍的LOOP體積
要使用專用的液相注射器進樣絕對不可以用氣相的注射器
自動進樣器使用注意
使用自動洗針功能
自動洗針功能可以把程序設(shè)置為“帶有洗針的進樣”,或?qū)⒆詣酉瘁樄δ馨谶M樣器程序中。當(dāng)使用自動洗針功能時，進樣針在取樣后會轉(zhuǎn)移到洗針 步驟。造成攜留效應(yīng)的主要原因是殘留在進樣針外的少量樣品。通過進樣后 的洗針功能可以立即洗去針外表面上殘留的樣品。當(dāng)進樣閥轉(zhuǎn)回到主流路時，定量管和針內(nèi)所有的樣品都被沖洗到色譜柱中。這種結(jié)合洗針和沖洗管 路的設(shè)計可以把攜留效應(yīng)減低到最小的程度。
去掉洗滌瓶蓋：為了獲得最佳的分析結(jié)果，裝有溶劑的洗滌瓶是不加蓋的，而且洗滌瓶中的 溶劑對樣品組分有較好的溶解作用。如果洗滌瓶有蓋將會有少量樣品留在密封墊上，這樣會把殘留的樣品帶到下一個樣品中。
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